尽管近年来取得了巨大成果，超分辨显微镜还是一个相对年轻的领域，而且这个领域中很多缩写词的含义不够深入人心。不过，随着超分辨显微镜打开更宽的成像应用之门，它将带来科学的神奇时刻。
超分辨光学显微镜是过去十年生命科学最重要的发展之一——而且它的进展还在继续。由于发展如此迅速和重要，以至于一些评论者称之为“分辨率革命”。
多色sted图像
生物医学应用的要求非常多——高空间和时间分辨率、长采集时间、3d成像、深度组织/in vivo成像等等。使用聚焦光的远场光学显微镜是一种重要的工具，特别是对于活体细胞和有机体的研究。不幸的是，光学显微镜是受限的；光的衍射限制图像的空间分辨率。
比如，衍射限制意味着只能以一定程度观察细胞蛋白质分布的细节。幸运的是，近年来见证了超分辨远场光学显微镜(纳米尺度)技术，比如sted、gsdim、resolft、palm、storm、sim或ssim，这些技术都以某种方式致力于解决远场光学显微镜在空间分辨率受限的问题。
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超分辨显微镜是多种超越衍射极限技术的统称，大多达到纳米尺度。举例如下：
sim：structured illumination microscopy，结构化照明显微镜
sted：stimulated emission depletion microscopy，受激发射耗尽显微镜
palm/storm/gsdim：photo-activated localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy/ground state depletion microscopy followed by inpidual molecule return，光活化定位显微镜/随机光学重构显微镜/基态耗尽显微镜
resolft：reversible saturable optical linear fluorescence transition，可逆饱和荧光跃迁
ssim：saturated structured illumination microscopy，饱和结构化照明显微镜
csrem/clem: correlative superresolution optical and electron microscopy/correlative light and electron microscopy，互关联超分辨光学和电子显微镜/互关联光学和电子显微镜
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局部细胞中肌动蛋白纤维骨架的3d-storm图像，该投影图像使用颜色定义深度。
sim相比传统的光学显微镜在空间分辨率上提高了两倍，但是sted、resolft、palm/storm和ssim进展更大，将光学图像分辨率的极限推向纳米尺度。所有这些超分辨技术都拓宽了生物医学研究的视界。
“从原理上讲，任一种超分辨技术都可以应用在任一种样品，提供‘超解析的’图像，”利兹大学阿斯伯利中心的michelle peckham教授说。“实际上，每一种选择都要考虑到染料、探针、抗体或者适用的荧光蛋白标记，当然还有设备和易用性。”
sim：虽然复杂，但是一种良好的折中
“sim应用结构化照明，分辨率相比传统显微镜提高了两倍——不像sted/resolft和palm/storm一样需要开关光子，”牛津大学wolfson成像中心的首席研究员和科学总监christian eggeling教授说。“因此，sim可以用于传统样品，不管是固定或活体细胞，甚至以3d成像。”
对于很多生物成像，提高两倍是足够好的，所以sim是空间分辨率和长采集时间之间的良好的折中。但是也有些劣势。
“storm/palm需要繁琐的数据分析，这是很多人不善长的。只有很少可用的程序代码，”eggeling说，“因此数据分析可能失真。人们正在试着改善，开发控制软件检查失真，比如说sim失真检查。”
alistair curd：利兹大学peckham团队中的一名3d storm/palm研究员
另一个劣势是，最终生成一张图像需要记录多个图像，这会延长采集时间，也因此降低时间分辨率，尤其对于3d记录。当然，sim的记录时间已在逐步得到改善，而且诸如复扫描或艾里扫描显微镜等越来越多的相关技术也在出现。总体而言，sim和相关技术是一种良好的折中，它可能是原子核/染色体成像的最佳技术。
sted：所见即所得
stem直接得到图像，不像sim需要繁琐的数据分析。sted不仅简单，而且相当通用，所以适合固定和活体细胞。从原理上讲，它利用了共聚焦/宽场显微镜用的典型标记染料。
使用isim显微镜采集的活体细胞中的egfp-eb1图像
“sted技术能以纳米分辨率对亚细胞结构进行光学成像。多光子激发荧光成像提供内部光学切面、有限的光漂白和光毒性、以及更深的穿透，这些对于散射组织都是关键优势，”光谱物理的产品市场高级经理julien klein说。
光谱物理提供超快激光器用于混合型sted显微镜，将超分辨和多光子激发(mpe)荧光的优势集成在单一装置中。
alexa cleasby研究员检查isim超分辨显微镜中光学元件的对准，该显微镜由利兹大学的pec
“在特定的配置方案中，你可以同时利用sted和mpe成像的优势，这需要一个光谱物理highq-2等飞秒红外1-08m激光器用于双光子激发，一个可见光连续激光器用于耗尽，”klein说。
sted的一个独有特性是空间分辨率可以通过激光器的强度调节——2d和3d都行，而且从共聚焦尺度直低至理论的无限尺度。这在图像采集时有更大的灵活性。
“比如说，如果样品不是太亮或样品制备不够精确，那么可以牺牲空间分辨率提高信噪比，”eggeling说。“另一方面，空间分辨率的调谐还能进行一些独特的应用，比如sted-fcs(荧光关联光谱技术)，它能以前所未有的细节展现分子的散射模式。
共聚焦和sted显微镜图像对比
一般认为sted显微镜由于高激光光强会导致很强的光毒性，这是指标记物的光漂白和细胞活力。但是，如果在采集模式、标记方式和样品制备中非常小心，越来越多的活体应用都表明sted显微镜是一种适合以高空间和时间分辨率观察细胞动态的好工具。
超快激光器也能用于多种配置方案，比如生成双光子激发脉冲串或高重频啁啾耗尽光束。比如，使用玻璃棒和/或光纤将脉宽展宽到几百皮秒，那么光谱物理的mai tai等近红外激光器能产生高重频脉冲耗尽光束。
使用hyvolution 2采集的cos-7细胞图像
徕卡微系统的rolf borlinghaus将sted看做研究包含真正三维尺度的厚样品的最佳方法。通过超分辨技术hyvolution 2和tcs sp8 sted one nanoscope，徕卡微系统致力于帮助神经生物学、癌症研究和免疫学的科学家观察活体细胞中的分子相互作用和结构，从而理解生命的真正本性。
palm/storm/gsdim：最流行的技术
这些缩写虽然不同，但是它们的基本原理都是一样的。它们的流行是因为相对简单和高性价比的装置，因为经常只要普通的全内反射荧光(tirf)/宽场显微镜就足够。它能在普通实验中获得最高空间分辨率，而且标记可以使用传统染料和特殊缓冲来使它们闪烁，也可以使用特殊的光活化或光开关荧光团。
最早的palm/storm/gsdim出现在2006年，它们使用光诱导荧光开关在时间上分离单分子的空间重叠图像。这允许高精密地确定分子的位置，并根据这些位置重构亚衍射极限分辨率的图像。
“palm/storm/gsdim的分辨率因此不受衍射限制，而是受分子位置的测量精度限制，在某些情况下也受到被定位分子的密度限制，”eggeling说。
缺点包括：1）相当繁琐的数据分析，用户必须输入会引起失真/偏差的阈值；2）最终生成一张超分辨图像需要记录几十万张相机图像，这样导致采集时间太长，因此难以观察到较快的活体细胞动态；3）需要低背景噪声，因为需要开关和定位每个隔离的分子，因此tirf仍是首选采集模式。
当然，这种技术正在稳步改进，特别是在自动化无偏差数据分析、速度和更深样品成像等方面。新近出现一种称为miniflux技术——使用sted的特性改善定位精度，因此大大降低需要的光子数——将开辟新的途径，eggeling说。
resolft：柔光照明利于活体细胞成像
resolft应用和sted相同的原理，但是使用的是可逆光开关荧光标记。由于使用这些标记，通过远小于sted的激光强度就能取得超分辨率。柔光照明允许以纳米尺度长期记录细胞和组织中的神经蛋白和它们的动态。
“不幸的是，可逆光开关荧光标记的可用性限制了它的一般应用，“eggeling说。“但是这些也在不断改进并变得更实用。”
ssim：应用有限
ssim使用可逆光开关，空间分辨率相比sim改进了两倍。但是问题还是和sim和resolft一样——除了原理验证，实际应用也非常有限。
csrem或clem：电子和光学显微镜的结合
csrem或clem是电子显微镜和storm或palm等超分辨技术的结合。它只能应用于固定样品，与标记物一起识别某些样品区域，一般是使用金微珠或盖玻片上的标记。
利兹大学的peckham说：“这种技术对于活体细胞的超分辨成像有利——以高分辨率检查特殊蛋白质的行为，然后快速固定(比如使用高压凝固)，并用电子显微镜成像去研究周围细胞超结构中的蛋白。”
当前和未来的发展
越来越多实验室在日常中使用sted、resolft、palm和storm探测长度远小于成像光波长的透明物质。其中有些技术正用于产出关于膜结构和神经科学的信息，也用于研究阿兹海默症和亨廷顿症相联系的蛋白质凝聚的形成机制。
但是要获得更好的空间分辨率并非易事——精确的样品制备和优化标记是关键。
“一般而言，使用超分辨显微镜需要非常小心地制备样品。不合理的标记或不合理的固定对于共聚焦/宽场显微镜可能不要紧，但是会严重恶化超分辨图像，“eggeling说。”类似的，如果细胞固定不好，那么超分辨成像要比传统共聚焦/宽场成像中细胞死亡更快。”
有新技术尝试在改善空间分辨率和装置/分析的复杂性之间考虑折中。目前有些公司提供艾里扫描或isim显微镜，两者和sim类似，只需在传统共聚焦或宽场显微镜中做一些简单的添加就能提高达1.7倍空间分辨率。另外，有机化学家不断改善荧光标记的光子产量也是未来改进的基础。
isim一瞥中复杂的光路
finch(fresnel incoherent correlation holography)显微镜是gary brooke教授(约翰霍普金斯大学显微中心主任和celloptic公司ceo)和nisan siegel(约翰霍普金斯大学生物医学工程部研究员)开发的。
finch是一种非相干全息的形式，从物镜出射的非相干光通过一个单光束系统生成全息图。物镜发射的光都被分成两束，差分相位调制每一束光并在公共平面上重新合束生成干涉条纹。自然光子学(doi: 10.1038/nphoton.2016.207)重点介绍了finch显微镜快速生成超分辨生物图像的能力。
“finch以简单和易用从其它超分辨技术中脱颖而出，它只要求特殊的成像透镜和快速计算，不用复杂的照明配置、极大数据集，也没有限制染色选项，”brooker说。“finch能以各种速度提供和sim相似的分辨率，能对几乎任意显微应用进行活体细胞成像。”根据j. phys. d: appl. phys.杂志文章2015 super-resolution microscopy roadmap，下一步发展是扩大超分辨显微镜的应用，解决更广的科学范畴。换言之，这意味着显微镜必须能用于更宽的样品范围。
roadmap的合作者有领域中一些大名鼎鼎的专家，比如stefan hell和eggeling，文章强调通过自适应光学访问较厚的样品将能够在组织中更多地使用超分辨技术，有望更好地辅助发展生物学、神经科学和其它领域的研究。
使用自适应光学的另一优势是提高超分辨的可用性，因为它有望达成系统的自校准和自动对准，因此减少现场技术支持的需求。这些进展着手将这些超分辨技术变成普通的实验室工具。