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dna甲基化在dna甲基化转移酶(dnmts)的作用下的cpg二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶，是最早发现的修饰途径之一。原核生物中甲基化多发生在cca/tgg和gatc序列；真核生物中dna甲基化一般发生在cpg位点上；哺乳动物dna甲基化只发生在cpg岛的胞嘧啶,植物甲基化发生在cpg和cpnpg。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶,cpg位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置,统称为cpg岛。cpg位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。
dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。dna甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。这种dna修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。
目前，甲基化检测的主要研究方法是基于亚硫酸氢盐处理的甲基化特异性pcr(methylation-specificpcr,msp)和亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing pcr,bsp)。除此之外，还有高分辨率熔解曲线法(high reso- lutionmelting,hrm)和焦磷酸测序法。
msp
甲基化特异性的pcr是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。用亚硫酸氢盐处理基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物,如果用针对处理后甲基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之,说明被检测的位点不存在甲基化。
该方法具有以下优点:
1、检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的gdna；
2、快速、简单,省时；
3、可结合real-timepcr技术(taqman 探针) 对样品中检测位点甲基化水平进行定量。
bsp
亚硫酸盐测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组dna甲基化模式的方法。用亚硫酸氢盐处理基因组dna，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。最后对pcr产物进行测序，可以判断cpg位点是否发生甲基化。将pcr产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-克隆测序法。
该方法具有以下优点:
1、特异性高：能提供高特异性分析结果，是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；
2、灵敏度高：可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的gdna进行分析就能得到各个dna分子精确的甲基化位点。
hrm
高分辨率熔解曲线法，是近年来兴起的甲基化检测的新方法。在非cpg岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的dna双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的cpg岛。若这些cpg岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经pcr扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的gc含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。
焦磷酸测序法
焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是由4种酶(dna聚合酶(dna polymerase)、atp硫酸化酶(atpsulfu-rytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dntp)。如果该dntp与模板配对，则会在dna聚合酶的作用下，添加到测序引物的3\'末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(ppi)。掺入的dntp和释放的ppi是等量的。cpg甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(ppi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测cpg对应位点上c/t渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。
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